• 形态学特征：贴壁生长时呈多边形或梭形，融合后形成铺路石样单层，高倍镜下可见细胞间连接复合体（如桥粒）及细胞质内张力丝（电镜观察）；
• 免疫表型：特异性表达胸腺上皮细胞标志物，包括细胞角蛋白 19（CK19）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、主要组织相容性复合体 Ⅱ 类分子（MHCⅡ），以及 Wnt 信号通路关键分子 β- 连环蛋白（β-catenin）；不表达造血细胞标志物 CD45，证实上皮细胞纯度＞95%；
• 功能特性：具备胸腺上皮细胞典型功能，如分泌胸腺素 β4（Thymosin β4）、趋化因子 CCL25，以及通过表达自身抗原（如胰岛素样蛋白 2，INSL2）诱导 T 细胞**耐受。核型分析显示为正常二倍体（2n=42），无致瘤性，建议传代次数≤12 代以维持表型稳定。

二、高效培养体系的建立

1. 培养基优化配方
   • 基础培养基：推荐使用 RPMI 1640 培养基，添加 15% 胎牛血清（FBS，需经胸腺细胞增殖实验筛选低内毒素批次）、1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、5 μg/mL 胰岛素及双抗（青霉素 100 U/mL + 链霉素 100 μg/mL）；
   • 功能强化添加物：若需模拟胸腺微环境，可额外加入 10 ng/mL 表皮生长因子（EGF）和 50 ng/mL 成纤维细胞生长因子 7（FGF7，即 KGF），促进细胞增殖及导管样结构形成。
2. 培养条件精细化管理
   • 气体环境：37℃、5% CO₂培养箱，湿度维持 95% 以上；培养基 pH 值需严格控制在 7.2~7.4（可通过 HEPES 缓冲液增强稳定性）；
   • 传代操作：当细胞融合度达 70%~80% 时，用 0.025% 胰酶 - EDTA 消化（37℃作用 2~3 分钟），按 1:2 比例传代，消化过度易导致细胞间连接破坏及 TSLP 分泌功能下降；
   • 冻存与复苏：冻存液采用 90% FBS + 10% DMSO，细胞密度调整为 1×10⁶ cells/mL，程序降温后液氮保存；复苏时以 37℃水浴快速解冻，台盼蓝染色显示活细胞率＞92%。
3. 质量控制关键点
   • 污染检测：每代细胞需通过支原体（Mycoplasma）PCR 检测及细菌 / 真菌培养，确保无菌；
   • 功能验证：定期通过 ELISA 检测胸腺素 β4 分泌水平（正常范围：50~80 pg/mL），或通过与胸腺细胞共培养实验（如 CFSE 标记的 CD4⁺CD8⁺双阳性细胞增殖率＞30%）验证基质细胞功能。

三、科研应用场景与典型研究

1. 胸腺发育与 T 细胞分化机制
   RNTEC/HL-026 可模拟胸腺皮质上皮细胞（cTEC）功能，研究 T 细胞发育关键信号：
   • Notch 信号通路：通过 γ- 分泌酶抑制剂（如 DAPT）阻断 Notch1 配体（如 Delta-like 4, DLL4），观察双阳性 T 细胞向 CD4⁺或 CD8⁺单阳性细胞分化受阻；
   • Wnt/β-catenin 通路：过表达 β-catenin 激活剂（如 LiCl）可促进上皮细胞表达 AIRE（自身免疫调节因子），诱导 T 细胞对自身抗原的耐受性。
     案例：某团队利用该细胞系证实，维生素 D₃通过上调 cTEC 表面 CD1d 分子表达，促进 invariant natural killer T（iNKT）细胞的阳性选择，为免疫耐受调控提供新靶点。
2. 自身免疫性疾病模型构建
   • 重症肌无力（MG）研究：通过脂多糖（LPS）刺激细胞，诱导 MHCⅡ 类分子及 TSLP 过度表达，模拟胸腺上皮细胞异常激活导致的自身反应性 T 细胞逃逸；
   • 系统性红斑狼疮（SLE）机制：检测细胞分泌的 BAFF（B 细胞活化因子）水平，发现 IFN-γ 可通过 JAK-STAT 通路增强 BAFF 表达，促进自身反应性 B 细胞存活。
     案例：在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，该细胞系分泌的 CCL25 可趋化初始 T 细胞向胸腺迁移，加剧**神经系统炎症，提示胸腺上皮细胞在自身免疫病中的双重作用。
3. 免疫重建与再生医学
   • 造血干细胞移植（HSCT）辅助研究：与脐带间充质干细胞（UC-MSC）共培养，评估间充质干细胞对胸腺上皮细胞损伤（如化疗药物顺铂诱导）的修复作用，通过 Ki67 染色检测细胞增殖率提升；
   • 生物人工胸腺构建：将细胞接种于脱细胞胸腺细胞外基质（dECM）支架，结合 3D 生物打印技术，构建具备 T 细胞教育功能的类器官模型。
     案例：研究发现，低氧预处理（1% O₂）的 RNTEC/HL-026 可通过 HIF-1α 通路增强血管内皮生长因子（VEGF）分泌，促进移植后胸腺血管化，为衰老胸腺再生提供新策略。
4. 药物免疫毒性评估
   • 免疫抑制剂筛选：检测环孢素 A（CsA）对细胞分泌胸腺素 β4 的抑制作用（IC₅₀约为 10 nM），结合 T 细胞增殖实验验证免疫抑制效果；
   • 纳米药物**性评价：评估脂质体载体对上皮细胞紧密连接的影响（如跨上皮电阻 TEER 值下降＞30% 提示屏障损伤）。

四、应用局限性与优化策略

1. 模型局限性：
   • 该细胞系来源于大鼠，与人胸腺上皮细胞的转录组差异显著（如 AIRE 表达水平较低），涉及临床转化时需结合人原代胸腺上皮细胞（hTEC）或诱导多能干细胞（iPSC）来源的胸腺类器官；
   • 单层培养难以模拟胸腺特有的皮质 - 髓质分区结构，建议采用 Matrigel 三维培养或与胸腺成纤维细胞、树突状细胞共培养，重构微环境。
2. 实验设计注意事项：
   • 研究 T 细胞 - 上皮互作时，需使用 Transwell 小室（0.4 μm 孔径）避免细胞直接接触，或通过磁珠分选纯化上皮细胞；
   • 检测分泌型细胞因子时，需提前用无血清培养基饥饿处理 12 小时，减少血清成分干扰。

五、总结