一、细胞来源与生物学特性

1. 制备背景与技术路线

• 免疫阶段：以目标抗原（如蛋白质、多肽、细胞表面分子等）免疫BALB/c 小鼠，刺激脾淋巴细胞产生特异性 B 细胞。
• 细胞融合：取免疫小鼠脾细胞与 ** 骨髓瘤细胞（如 SP2/0 或 NS0）** 在聚乙二醇（PEG）介导下融合，形成杂交瘤细胞。
• 筛选与克隆化：通过HAT 培养基筛选去除未融合的亲本细胞，再经有限稀释法克隆化培养，*终获得单一克隆的 2G9B9H6A2 细胞。

2. 核心生物学特征

• 细胞形态：悬浮生长，呈圆形或类圆形，直径约 8–12 μm，细胞核居中，细胞质可见少量颗粒（与抗体合成相关）。
• 生长特性：对数生长期倍增时间约 18–24 小时，适宜接种密度为 ，*高耐受密度可达 $2\times 10^6\text{cells/mL}$。
• 抗体分泌特性：
  • 亚型：通常为 IgG1、IgG2a 或 IgM（需通过亚型鉴定试剂盒确认）。
  • 特异性：识别单一抗原表位，效价可达 （腹水或培养上清中）。
  • 稳定性：传代 30 代以上仍保持抗体分泌能力，冻存复苏后活性恢复率≥90%。

二、培养条件与操作规范

1. 培养基与环境

• 基础配方：
  • 完全培养基：RPMI 1640 或 DMEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 双抗（青霉素 100 U/mL + 链霉素 100 μg/mL），pH 调至 7.2–7.4。
  • 筛选阶段：早期传代需添加 HAT 培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶），维持 2–3 周后逐步过渡至 HT 培养基或普通完全培养基。
• 培养环境：37℃、5% CO₂恒温培养箱，湿度≥90%，避免频繁开盖导致污染。

2. 传代与冻存

• 传代时机：当细胞密度达到  且存活率＞90% 时，按 1:3–1:5 比例传代。操作步骤：
  1. 取细胞悬液至离心管，1000 rpm 离心 5 分钟；
  2. 弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，调整密度至 。
• 冻存方法：
  • 冻存液：90% FBS + 10% DMSO（或专用细胞冻存液），细胞密度 。
  • 程序降温：-80℃冰箱过夜后转至液氮保存，记录冻存位置与代数。

3. 质量控制

• 无菌检测：每 2 周取培养上清接种于血琼脂平板和肉汤培养基，37℃培养 48 小时，观察有无细菌或真菌生长；支原体检测可采用 PCR 法或荧光染色法。
• 抗体活性验证：通过 ELISA 检测上清抗体效价，Western blot 验证抗原特异性，确保细胞未发生表型丢失。

三、应用场景与研究价值

1. 单克隆抗体制备与诊断试剂开发

• 医学诊断：
  • 开发胶体金试纸条或化学发光试剂，用于病原体（如新冠病毒 N 蛋白、HIV 抗原）检测。
  • 制备流式细胞术抗体，用于白血病免疫分型或细胞表面标志物（如 CD 分子）分析。
• 科研工具：作为免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）或免疫沉淀（IP）的工具抗体，用于蛋白质定位、互作或修饰研究。

2. 肿瘤免疫与治疗研究

• 抗体 - 药物偶联物（ADC）：通过 linker 将细胞毒素（如 MMAE）与抗体结合，精准杀伤肿瘤细胞。
• 免疫治疗协同研究：与 PD-1 抑制剂联用，评估对肿瘤微环境中 T 细胞活性的调控作用。

3. 其他前沿领域

• 神经科学：若抗体靶向神经损伤相关蛋白（如 Nogo-A），可用于脊髓损伤修复机制研究。
• 细胞治疗质量控制：作为质控抗体检测 CAR-T 细胞的抗原结合活性或纯度。

四、优势与挑战

优势：

1. 高特异性：单克隆抗体仅识别单一表位，适用于复杂样本中微量抗原的检测（如血清肿瘤标志物）。
2. 可规模化生产：通过悬浮培养或腹水诱生法（接种至小鼠腹腔），可大量制备高纯度抗体。
3. 实验重复性强：细胞系遗传背景明确，适合长期稳定性实验（如药物毒性评估）。

挑战：

1. 人源化需求：小鼠源抗体可能引发人体免疫反应，需通过基因工程改造（如嵌合抗体、纳米抗体）降低免疫原性。
2. 培养优化成本：部分细胞对血清批次敏感，需筛选适配的 FBS 或尝试无血清培养基。
3. 表型漂移风险：长期传代可能导致抗体分泌量下降，建议每 10 代进行一次克隆化筛选。

五、注意事项与操作建议

1. 复苏技巧：冻存管从液氮取出后，立即放入 37℃水浴快速解冻（≤1 分钟），避免冰晶损伤细胞。
2. 污染预防：操作需在生物**柜中进行，接触细胞的耗材需严格灭菌，避免交叉污染。
3. 伦理与合规：涉及人类样本的研究需遵守《赫尔辛基宣yan》，动物实验需通过伦理审查。

总结