●(多种属)操作流程●: 1. 检测试剂盒(多种属)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL; 3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。 4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
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●稳定转染●:即进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。这是相对瞬时转染而言的。 瞬时转染的表达时间短暂,外源基因导入整合基因组的几率非常低,绝大部分以游离形式存在,不能随细胞分裂而一同复制,导致后拷贝数被稀释,无法达到持续表达外源基因的目的。一般用转染试剂进行质粒转染,多为瞬时转染。 ●一般如下情况需要构建稳定株●: 1. 长期在目的细胞中研究基因功能,通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也极大方便实验研究; 2. 部分蛋白半衰期极长,瞬时 RNA 只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,通过构建稳定株可以实现更好的基因干扰效果; 3. 瞬转往往会引入极高拷贝数的表达,导致因为人为因素造成实验结果的不**,构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究; 4. 需要用诱导表达系统的,主要是一些致死基因或者是需要时空表达的; 5. 需要用细胞做动物实验的,比如裸鼠成瘤等,往往需要构建成稳转株。
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编辑:小檀20180925
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